新冠肺炎核酸檢測假陰性率為何這么高

新冠肺炎核酸檢測假陰性率為何這么高

專家稱病毒核酸被降解導致不能正常檢出

本報記者 張 曄

新冠肺炎疫情發生以來，關于核酸檢測假陰性率過高的話題，一直是各方關注的焦點。有報道稱，以熒光定量RT-PCR作為檢測手段的新冠病毒檢測的陽性率目前僅有30%—50%，導致奇高的假陰性率。

導致假陰性率發生的原因很多。2月22日，南京大學模式動物研究所發育生物學與遺傳學教授趙慶順接受科技日報記者獨家采訪時指出，依據有關機構發布的指南，核酸檢測前需將采集到的樣品進行56℃滅活，這極有可能使新冠病毒核酸被降解，從而導致不能被正常檢出，最終提高了假陰性率。該研究成果《病毒核酸提取前的高溫滅活過程顯著降低可檢出病毒核酸模板量》，已在中國科學院科技論文平臺預發布。

56℃滅活可能導致病毒核酸被降解

2019新型冠狀病毒的遺傳物質是單鏈RNA。因此，科研人員的目標是在患者身上找到新冠病毒的RNA。這也是臨床診斷金標準。

目前，臨床檢測主要采用熒光定量RT-PCR試劑盒檢測。該方法是將標本中的特定RNA序列逆轉錄后進行擴增，經過30次以上擴增后，病毒基因片段達到一定數量即可進行可視檢測。

“理論上，哪怕模板只有1個病毒，就有可能被檢測出來。”趙慶順說，科研實踐中，在模板(病毒)量大于100個的情況下，擴增結果就會非常穩定。

但是，趙慶順在網絡上看到一個教學視頻，不禁心生疑慮。該視頻由北京協和醫院和北京市衛健委聯合制作。視頻3分08秒至3分40秒顯示：在制備核酸模板前，需將采集到的樣品在56℃條件下進行30分鐘病毒滅活。

記者在中華醫學會檢驗醫學分會發布的《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南(試行第一版)》中也看到：核酸擴增前，可以對標本先行消毒。包括56℃孵育30分鐘，加蛋白酶K。

中華醫學會檢驗醫學分會發布的《新型冠狀病毒肺炎病毒核酸檢測專家共識》中，明確指出需將樣品56℃孵育至少45分鐘或更高溫度進行滅活。

記者通過采訪確認，絕大多數檢驗醫師均按照上述規范，進行56℃條件下時間不等的病毒滅活，然后才制備核酸模板。

這樣做帶來的問題是，病毒RNA極易被核糖核酸酶降解，因為這種酶在60℃時活性最高。核糖核酸酶來自兩方面，一是樣本細胞內，二是采集、保存、運輸過程中的外來污染物。

進行滅活處理是出于生物安全的考慮

“進行滅活處理是出于生物安全的考慮，保護從事檢測的工作人員不被病毒感染。”趙慶順說。

正是出于這方面的考慮，國家衛健委發布的相關文件中，明確要求對標本進行滅活處理。

北京協和醫院制作的教學視頻以及中華醫學會檢驗醫學分會發布的《防護指南》和《專家共識》，依據正是來自國家衛健委相關文件，包括《新型冠狀病毒實驗室生物安全指南(第二版)》《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南(第三版)》等。

但是，記者查詢了國家衛健委相關文件，其對于病毒滅活的具體方法并未做出明確規定，只是籠統地要求：感染性材料或活病毒在采用可靠的方法滅活后進行的核酸檢測。

趙慶順進一步查閱了美國疾控中心、香港大學公共衛生學院以及華大基因發布的核酸檢測說明，也未發現56℃滅活這一步驟。

病毒核酸降解對檢測結果影響究竟有多大

記者在采訪中發現，不同人士對這個問題的回答涇渭分明：

來自疾控部門、中國醫學會檢驗醫學分會、相關醫院檢驗醫師的看法是，不會對檢測結果有太大的影響。而趙慶順等專家認為，核酸提取前對人體樣品進行高溫殺毒處理，可能是導致新冠病毒核酸檢出假陰性率過高的重要原因之一。

趙慶順以豬流行性腹瀉病毒(一種冠狀病毒，來自活疫苗)為模型開展了高溫滅活對病毒可檢出量影響的研究，結果表明：保存在普通等滲溶液(Hank’s液)中的樣品經56℃孵育30分鐘，導致樣品中可檢出的冠狀病毒模板減少一半，如果以92℃孵育5分鐘，則可檢出的冠狀病毒模板損失96%以上。

“理論上，不排除新冠病毒的目標RNA片段在56℃以上高溫滅活中不易被降解的可能。”趙慶順坦言，“但我寧愿自己的判斷是錯的，也不希望因為某個細節考慮不周而導致檢測結果出現假陰性。”

另外，不同品牌的樣品保存液，也會對檢測結果產生較大影響。趙慶順在實驗中發現，在56℃30分鐘條件下，采用南京諾唯贊研發的R503保存液存放豬流行性腹瀉病毒樣品時，病毒核酸的可檢出量是對照組(Hank’s液)檢出量的3倍；而如果是92℃5分鐘滅活，則檢出量是對照組的42倍。

中華醫學會檢驗醫學分會主任委員王成彬教授在撰文回應核酸檢測假陰性率較高現象時也指出，不同提取試劑對最后提取到的核酸數量和質量可能存在差別，從而直接影響檢測結果。他建議，對于某些高度疑似病例，或檢測結果難以確定的病例，建議用2種以上試劑進行檢測、驗證。

“假陰性意味著漏檢，不僅會導致臨床中對疑似患者不能快速確診，而且會使漏檢者成為潛在的病毒傳染源。”趙慶順為此提出建議，一是盡量使用無核糖核酸酶污染的樣本采集管，二是將標本放置在可保護病毒核酸免受高溫滅活損壞的樣品保存液中，從而確保樣品RNA從保存、運輸到高溫滅活等得到全程保護，盡最大可能保證用于臨床檢測的核酸質量，減少病毒核酸可檢出模板在核酸提取前的人為損壞。